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Peptide 3XFLAGè un'importante sequenza di marcatori peptidici ampiamente utilizzata nei processi di espressione e purificazione delle proteine nella ricerca biomedica. Formula molecolare C120H169N31O49S, CAS 402750-12-3. Composta da 23 aminoacidi, la sua sequenza contiene tre motivi ripetuti Asp Tyr Lys Xaa Xaa Asp, che gli conferiscono caratteristiche strutturali specifiche.
Ha una buona solubilità in solventi specifici. Ad esempio, nel DMSO la sua solubilità è elevata, rendendolo conveniente per operazioni ed esperimenti in soluzione. Inoltre, può anche ottenere un buon effetto di dissoluzione in acqua attraverso un lieve riscaldamento. Ha anche alcune proprietà speciali. Ad esempio, ha una buona antigenicità e reattività e può legarsi a specifici anticorpi anti FLAG. Questa capacità di legame lo rende ampiamente applicabile in esperimenti come l'immunoprecipitazione. Legandosi in modo competitivo agli anticorpi Anti FLAG, la proteina espressa dalla fusione FLAG che si lega agli anticorpi Anti FLAG può essere eluita durante l'immunoprecipitazione, ottenendo così la localizzazione, il rilevamento e la purificazione della proteina bersaglio.
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Tappi e tappi di bottiglia personalizzati:
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Formula chimica |
C120H169N31O49S |
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Messa esatta |
2860 |
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Peso Molecolare |
2862 |
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m/z |
2861 (100.0%), 2860 (77.0%), 2862 (32.9%), 2862 (31.4%), 2863 (22.1%), 2862 (11.5%), 2863 (10.1%), 2861 (8.8%), 2864 (8.1%), 2862 (7.8%), 2863 (7.4%), 2863 (5.3%), 2863 (4.5%), 2862 (3.5%), 2864 (3.3%), 2864 (3.2%), 2865 (2.2%), 2865 (2.1%), 2864 (2.1%), 2862 (1.9%), 2862 (1.9%), 2861 (1.5%), 2864 (1.5%), 2861 (1.4%), 2864 (1.4%), 2863 (1.2%), 2864 (1.2%) |
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Analisi elementare |
C, 50.36; H, 5.95; N, 15.17; O, 27.39; S, 1.12 |
Peptide 3XFLAGè un tag utilizzato nella ricerca sulle proteine, costituito da 8 aminoacidi con la sequenza DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK. La sua funzione principale è quella di fungere da marcatore per l'espressione e la purificazione delle proteine, fornendo un mezzo conveniente ed efficiente nella ricerca.
1. Purificazione dell'affinità:
Può essere utilizzato come etichetta per la purificazione delle proteine e, grazie alla sua elevata affinità con gli anticorpi anti FLAG, la proteina bersaglio può essere facilmente purificata. Solitamente, la proteina bersaglio viene co-trasfettata in cellule con un vettore di espressione contenente 3X FLAG PEPTIDE e quindi purificata per affinità utilizzando anticorpi anti FLAG per ottenere in modo rapido ed efficiente una proteina bersaglio di elevata purezza.
2. Test immunologici:
Grazie alla sua elevata immunogenicità, può essere utilizzato per rilevare l'espressione e la localizzazione delle proteine. Utilizzando specifici anticorpi anti FLAG, è possibile eseguire tecniche sperimentali come l'immunoblotting e la colorazione con immunofluorescenza per rilevare in modo rapido e accurato il livello di espressione e la distribuzione delle proteine bersaglio.
3. Filtro clone:
Può essere utilizzato anche per la comodità dello screening dei cloni proteici. Nel processo di costruzione dei vettori di espressione proteica, il collegamento della sequenza genetica della proteina bersaglio con la sequenza 3XFLAG può facilitare lo screening di cloni positivi con la proteina bersaglio attraverso il rilevamento immunitario e altri metodi, accelerando così il processo di ricerca sulla funzione proteica.
4. Immunoprecipitazione:
Può anche essere utilizzato per esperimenti di immunoprecipitazione delle proteine. Legando proteine contenenti tag 3X FLAG PEPTIDE agli anticorpi anti FLAG e quindi utilizzando materiali di adsorbimento come agarosio proteico A/G o sfere magnetiche, la proteina bersaglio e i suoi partner interagenti possono essere precipitati selettivamente da estratti cellulari per studiare la rete di interazione proteica.
5. Screening farmacologico:
Può essere utilizzato anche nella ricerca sullo screening dei farmaci. Combinando il tag 3X FLAG PEPTIDE con la proteina di interesse, è possibile ottenere uno screening ad alta-rendimento della proteina. Questo metodo di screening può essere utilizzato per scoprire nuovi bersagli farmacologici, valutare le interazioni tra proteine e farmaci e così via.
6. Ricerca sulla funzione delle proteine:
L'introduzione delle etichette non influenza in modo significativo la struttura naturale e la funzione delle proteine e può quindi essere utilizzata per studiare le funzioni biologiche, la localizzazione subcellulare, le interazioni e la trasduzione del segnale delle proteine. Introducendo il tag 3X FLAG PEPTIDE, è possibile condurre ricerche approfondite sulle caratteristiche biologiche delle proteine, il che aiuta a rivelarne i meccanismi d'azione nella biologia e fisiologia cellulare.
Peptide 3XFLAGè un peptide contenente 8 aminoacidi, con la sequenza DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK. È comunemente usato come tag proteico per una comoda purificazione, rilevamento e ricerca delle proteine bersaglio. Nel processo di biosintesi, può essere preparato mediante sintesi chimica o metodi di ingegneria genetica. Di seguito sono riportate le fasi dettagliate dei metodi di ingegneria genetica:
1. Progettare e sintetizzare i geni:
Innanzitutto è necessario progettare un gene artificiale contenente la sequenza 3X FLAG PEPTIDE. Questo gene dovrebbe contenere la sequenza 3X FLAG PEPTIDE, nonché promotori, terminatori e marcatori di selezione appropriati (come i geni di tolleranza agli antibiotici). La progettazione dei geni dovrebbe considerare le caratteristiche e le esigenze di espressione dell'ospite bersaglio.
2. Clonazione genetica:
Successivamente, i geni artificiali progettati verranno clonati in vettori di espressione appropriati. I vettori comunemente utilizzati includono plasmidi, vettori virali, ecc. Il processo di clonazione include in genere i seguenti passaggi:
-Amplificazione PCR: utilizzo della reazione a catena della polimerasi (PCR) per amplificare la sequenza del gene bersaglio dal DNA modello.
-Digestione e connessione: i prodotti della PCR vengono digeriti con vettori di espressione utilizzando endonucleasi di restrizione e quindi collegati insieme tramite ligasi del DNA.
-Trasformazione: trasformazione del vettore di espressione connesso in ospiti batterici come Escherichia coli per formare un plasmide ricombinante.
-Identificazione: i plasmidi ricombinanti sono stati identificati tramite PCR, digestione enzimatica, sequenziamento del DNA e altri metodi per confermare che il gene bersaglio è stato clonato con successo nel vettore.
3. Proteina bersaglio dell'espressione:
Trasfetta il vettore di espressione costruito in cellule ospiti bersaglio, come cellule di mammifero, cellule di lievito, cellule di insetti, ecc. All'interno delle cellule, il vettore di espressione viene trascritto in mRNA e quindi tradotto in proteine.. 3X FLAG PEPTIDE sarà espresso insieme alla proteina bersaglio come tag proteico.
4. Estrazione delle proteine:
Raccogliere le cellule trasfettate ed eseguire la frammentazione cellulare, la centrifugazione e altri trattamenti per ottenere l'estratto proteico totale.
5. Proteine purificate:
Utilizzando tecniche di purificazione per affinità come immunoprecipitazione e cromatografia di affinità, le proteine bersaglio contenenti etichette 3X FLAG PEPTIDE sono state purificate dall'estratto totale. Ciò di solito comporta il legame degli anticorpi anti FLAG alle proteine contenenti 3X FLAG PEPTIDE e la successiva separazione mediante colonne per cromatografia di affinità o sfere magnetiche.
6. Identificare le proteine:
La proteina purificata è stata identificata e quantificata mediante elettroforesi su gel SDS-PAGE, immunoblotting, spettrometria di massa e altre tecnologie per garantirne la purezza e l'integrità.
Reazioni avverse
Nella ricerca biomedica e negli esperimenti relativi alle proteine, i peptidi tag svolgono un ruolo cruciale. Possono aiutare i ricercatori a purificare, rilevare e localizzare le proteine bersaglio, promuovendo notevolmente lo sviluppo della scienza delle proteine.Peptide 3XFLAGè un peptide tag comune e ampiamente utilizzato composto da tre sequenze ripetute di tag FLAG. Il tag FLAG è stato originariamente progettato da Hopp et al. nel 1988, e successivamente sviluppato in varianti come 3XFLAG, che hanno elevata affinità e specificità e possono legarsi ad anticorpi specifici, facilitando il successivo isolamento e identificazione. Sebbene 3XFLAG abbia apportato molti vantaggi negli esperimenti, come altri agenti biologici, può anche causare alcune reazioni avverse.
Reazioni avverse immuno-correlate
Immunogenicità
L'immunogenicità si riferisce alla capacità di una sostanza di stimolare il sistema immunitario del corpo a produrre una risposta immunitaria. 3XFLAG, come segmento peptidico esogeno, può essere riconosciuto dal sistema immunitario del corpo come un componente "non sé", innescando così una risposta immunitaria. Sebbene la sequenza 3XFLAG sia relativamente breve, in alcuni casi può comunque attivare le cellule B e T, portando alla produzione di anticorpi. Questi anticorpi non solo si legano al 3XFLAG libero, ma possono anche riconoscere e legarsi alle proteine di fusione che esprimono il tag 3XFLAG, influenzando la normale funzione e distribuzione della proteina di fusione.
Reazioni allergiche
La reazione allergica è una risposta immunitaria anomala causata dall'eccessiva sensibilità del sistema immunitario a determinati allergeni. Singoli individui possono manifestare reazioni allergiche durante l'utilizzo di 3XFLAG per la sperimentazione o il trattamento. La gravità dei sintomi delle reazioni allergiche varia. I casi lievi possono presentarsi con sintomi locali come prurito, eruzione cutanea ed eritema, mentre i casi gravi possono scatenare reazioni allergiche sistemiche come lo shock anafilattico, caratterizzato da un forte calo della pressione sanguigna, difficoltà di respirazione e perdita di coscienza, ponendo una seria minaccia alla sicurezza della vita.
Reazioni allergiche
Il meccanismo delle reazioni allergiche è principalmente legato agli anticorpi IgE presenti nel sistema immunitario. Quando l'organismo entra in contatto per la prima volta con 3XFLAG, il sistema immunitario lo riconosce come un allergene e stimola le cellule B a produrre anticorpi IgE specifici. Questi anticorpi IgE si attaccano alla superficie dei mastociti e degli eosinofili. Quando il corpo entra nuovamente in contatto con 3XFLAG, si lega agli anticorpi IgE sulla superficie cellulare, innescando i mastociti e gli eosinofili a rilasciare mediatori bioattivi come istamina e leucotrieni, portando alla comparsa di sintomi allergici.
Rischio di malattie autoimmuni
L'esposizione a lungo termine o ripetuta a 3XFLAG può aumentare il rischio di sviluppare malattie autoimmuni. Le malattie autoimmuni si riferiscono a un tipo di malattia in cui il sistema immunitario del corpo attacca erroneamente i propri tessuti e organi, provocando danni ai tessuti e compromissione funzionale. 3XFLAG può indurre il sistema immunitario a produrre anticorpi cross-reattivi e cellule T attraverso un meccanismo di simulazione molecolare, in cui la sua sequenza di aminoacidi è simile alla sequenza di alcune proteine nel corpo stesso.
Queste cellule immunitarie e anticorpi non solo attaccano il 3XFLAG estraneo, ma danneggiano anche inavvertitamente i normali tessuti del corpo, portando a malattie autoimmuni. Ad esempio, alcune malattie autoimmuni come il lupus eritematoso sistemico e l’artrite reumatoide possono essere correlate a reazioni autoimmuni indotte da sostanze esogene. Sebbene attualmente non vi siano prove chiare che suggeriscano che 3XFLAG causi direttamente malattie autoimmuni, questo potenziale rischio non può essere ignorato.
L'impatto sulla funzione cellulare
In alcuni studi sperimentali è stato riscontrato che elevate concentrazioni di 3XFLAG possono avere effetti tossici sulle cellule. Le manifestazioni di citotossicità comprendono cambiamenti nella morfologia cellulare, distruzione dell'integrità della membrana cellulare, alterazioni nell'attività enzimatica intracellulare e inibizione della proliferazione cellulare. Il suo meccanismo d'azione potrebbe essere correlato all'interazione tra 3XFLAG e la membrana cellulare. A causa della forte carica negativa di 3XFLAG,
può legarsi a componenti caricati positivamente sulla membrana cellulare attraverso interazioni elettrostatiche, alterando la permeabilità e la fluidità della membrana cellulare, portando alla fuoriuscita di sostanze intracellulari o all'ingresso di sostanze nocive dall'esterno, influenzando così le normali funzioni fisiologiche della cellula. Inoltre, 3XFLAG può anche entrare all’interno delle cellule, interferire con le vie di segnalazione, la sintesi proteica e altri processi, esacerbando ulteriormente il danno cellulare.
Effetti sulle vie di segnalazione cellulare
3XFLAG può interferire con le vie di segnalazione intracellulare e influenzare le normali attività fisiologiche delle cellule. La via di segnalazione cellulare è un termine collettivo per una serie di eventi molecolari in cui le cellule rispondono a stimoli esterni, regolando processi importanti come la crescita cellulare, la differenziazione e l'apoptosi.. 3XFLAG può interferire con la normale trasmissione delle vie di segnalazione interagendo con molecole chiave nella via di segnalazione, alterando l'attività o i livelli di espressione delle molecole di segnalazione.
Ad esempio, può legarsi ai recettori sulla superficie cellulare, inibendo in modo competitivo il legame dei ligandi naturali ai recettori e bloccando la trasmissione del segnale; In alternativa, può entrare nella cellula e legarsi alle proteine di trasduzione del segnale, influenzando la fosforilazione, la defosforilazione e altri processi di modificazione delle proteine, interferendo con la trasmissione e l'amplificazione del segnale. Questa interferenza con le vie di segnalazione cellulare può portare a disfunzioni cellulari, influenzando processi come la proliferazione, la differenziazione e l’apoptosi cellulare, che a loro volta possono avere effetti negativi sul normale sviluppo e funzione di tessuti e organi.
Effetti sul metabolismo cellulare
Metabolismo cellulare è il termine generale per una serie di reazioni chimiche che si verificano all'interno delle cellule, fornendo energia e materiale per le attività della vita cellulare.. 3XFLAG può influenzare i processi metabolici cellulari, interferire con la produzione di energia cellulare e la sintesi di sostanze. Ad esempio, può influenzare la funzione dei mitocondri, che sono i siti principali per la respirazione aerobica e la produzione di energia nelle cellule.. 3XFLAG può alterare la permeabilità e il potenziale della membrana mitocondriale interagendo con proteine o lipidi sulla membrana, influenzando la funzione della catena respiratoria mitocondriale e la sintesi di ATP,
portando ad un apporto energetico cellulare insufficiente. Inoltre,Peptide 3XFLAGpuò anche interferire con processi intracellulari come il metabolismo del glucosio e il metabolismo dei lipidi, influenzando l'equilibrio tra la sintesi e la decomposizione delle sostanze nelle cellule e avendo un impatto negativo sulle normali funzioni fisiologiche delle cellule
Domande frequenti
Cos'è una BANDIERA 3X?
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Il 3X FLAG Peptide è un peptide sintetico di 23 residui aminoacidici. Il motivo Asp-Tyr-Lys-Xaa-Xaa-Asp è ripetuto tre volte nel peptide. Otto amminoacidi al C-terminale costituiscono la classica sequenza FLAG (Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys).
Qual è la differenza tra flag-tag e 3xflag?
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Il tag-flag è una singola sequenza di 8 aminoacidi comunemente utilizzata nelle applicazioni di immunoprecipitazione, western blot e immunofluorescenza. Al contrario, 3x Flag-tag contiene 22 aminoacidi, il che gli conferisce una maggiore affinità per gli anticorpi anti-Flag e lo rende particolarmente vantaggioso per i flussi di lavoro di purificazione delle proteine.
Come sciogliere 3X FLAG?
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Per preparare una soluzione madre, scioglierla in TBS (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, con 150 mM NaCl) a una concentrazione di 5 mg/mL. Aliquotare e conservare a –20 gradi. Si sconsiglia il congelamento e lo scongelamento ripetuti.
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