Liraglutide Powder CAS 204656-20-2

Polvere di liraglutide, Formula molecolare C172H265N43O51, CAS 204656-20-2, Peso molecolare 1209,40. È un glucagone umano acilato sintetizzato artificialmente come l'analogo peptide-1 (GLP-1) con una somiglianza di sequenza superiore al 97% rispetto al GLP-1 naturale. Può essere sciolto in acqua, etanolo e glicole propilenico. La 34a posizione della lisina della molecola GLP-1 naturale è sostituita dall'arginina, che non solo preserva e prolunga il tempo di legame tra prodotti di acilazione e proteine, ma supera in modo significativo lo svantaggio della facile degradazione del GLP. In normali condizioni di stoccaggio, mostra una buona stabilità e la sua soluzione acquosa può mantenere la stabilità fisica e chimica per almeno 2 anni.

Tossicità genetica: i risultati del test Ames perPolvere di liraglutide, il test di aberrazione cromosomica per i linfociti del sangue periferico umano e il test del micronucleo del ratto erano tutti negativi.

Tossicità riproduttiva:

1. I ratti maschi sono stati iniettati per via sottocutanea con 0,1, 0,25 e 1,0 mg/kg/d di liraglutide 4 settimane prima dell'accoppiamento e durante l'accoppiamento. Alla dose di 1,0 mg/kg/die, la fertilità degli animali maschili non è stata direttamente influenzata. Secondo i calcoli del plasma AUC, l'esposizione sistemica generata da questa dose era circa 11 volte quella dell'esposizione umana alla massima dose umana raccomandata (MRHD). L'iniezione sottocutanea di 1,0 mg/kg in ratti femmine ha comportato un aumento della morte embrionale precoce, l'aumento di peso visibile e la riduzione dell'assunzione di cibo.

2. Da 2 settimane prima dell'accoppiamento al 17 ° giorno di gravidanza in ratti femmine, sono state somministrate iniezioni sottocutanee di 0,1, 0,25 e 1,0 mg/kg/d di liraglutide. Secondo i calcoli del plasma AUC, l'esposizione sistemica generata da queste tre dosi era di circa 0,8, 3 e 11 volte quella dell'esposizione umana sotto MRHD, rispettivamente. Nel gruppo dose da 1 mg/kg/d, si è verificato un leggero aumento del numero di morti embrionali precoci. A tutte le dosi, sono state osservate anomalie fetali, variazioni renali e vascolari, ossificazione irregolare del cranio e uno stato completo di eccessiva ossificazione. Ad una dose di 1,0 mg/kg/die, sono stati osservati fegato macchiato e leggera torsione delle costole. L'incidenza di malformazioni fetali supera lo stesso periodo e il controllo storico è: malformazioni orofaringee e/o stenosi alla gola che si aprono a una dose di 01mg/kg/d e difetti ombelicali a dosi di 0,1 e 0,25 mg/kg/d.

Dal 6 ° al 18 ° giorno di gravidanza, i conigli sono stati iniettati per via sottocutanea con liraglutide a concentrazioni di 0,01, 0,025 e 0,05 mg/kg/d. Secondo i calcoli del plasma AUC, l'esposizione sistemica dei conigli incinta era inferiore a quella degli umani durante MRHD. A tutte le dosi, il peso fetale è diminuito e l'incidenza complessiva di gravi anomalie fetali è aumentata in modo dose-dipendente. A dosi di 0,01 mg/kg/d (ossa di rene, spalla e milza), maggiore o uguale a 0,01 mg/kg/d (occhi e anteliminari), 0,025 mg/kg/d (cervello, coda e vertebrae, grandi vasi sanguigni e cardiaco ombelicale), maggiore o uguale a 0,025mg/kg/d (stenum). 0,05 mg/kg/d (osso parietale e grandi vasi sanguigni), l'incidenza di malformazioni ha superato quella dei controlli contemporanei e storici. L'ossificazione irregolare e/o le anomalie scheletriche si trovano nel cranio e nel colletto, vertebre e costole, sterno, pelvis, coccige e spalla e milza; C'è anche una leggera variazione scheletrica dose -dipendente visibile. Anomalie viscerali si trovano in vasi sanguigni, polmoni, fegato ed esofago. Tutti i gruppi di trattamento hanno mostrato doppi lobi o biforcazioni della cistifellea, ma non è stata osservata alcuna situazione simile nel gruppo di controllo.

4. Durante il periodo dal giorno 6 della gravidanza allo svezzamento o alla cessazione dell'allattamento il giorno 24, i ratti femmine sono stati iniettati sottocutaneamente con 0,1, 0,25 e 1,0 mg/kg/d di liraglutide. Secondo i calcoli del plasma AUC, l'esposizione sistemica era di circa 0,8, 3 e 11 volte quella dell'esposizione umana durante MRHD. Il periodo di consegna della maggior parte degli animali nel gruppo di trattamento è stato leggermente ritardato. Il peso medio dei neonati nel gruppo di trattamento era inferiore a quello nel gruppo di controllo. I ratti femmine nel gruppo di dose da 1,0 mg/kg/d hanno mostrato perdita di sangue e comportamento di eccitazione durante il parto. Il peso corporeo medio dei ratti della prole F2 nel gruppo di trattamento dalla nascita alla 14 ° giorno dopo la nascita era inferiore a quello del gruppo di controllo, ma le differenze tra i gruppi non hanno raggiunto un significato statistico.

Polvere di liraglutideè un glucagone umano acilato sintetizzato artificialmente come l'analogo peptide-1 (GLP-1) con una somiglianza di sequenza superiore al 97% rispetto al GLP-1 naturale. La struttura molecolare del liraglutide include le seguenti caratteristiche principali: la 34a posizione della lisina della molecola GLP-1 naturale è sostituita dall'arginina, che non solo conserva e prolungano il tempo di legame tra i prodotti di acilazione e le proteine, ma anche significativamente supera lo svantaggio della facile degradazione di GLP; Un'ulteriore catena laterale degli acidi grassi è stata aggiunta alla 26a lisina, che aiuta a prolungare l'emivita dei prodotti di acilazione in vivo. Questi cambiamenti molecolari unici hanno reso il delilaglutide a mostrare effetti eccezionali nel trattamento clinico, in particolare nel diabete e nella perdita di peso.

I metodi chimici per la sintesi di liraglutide includono principalmente i seguenti passaggi:

1. Sintesi del frammento

Innanzitutto, dividi l'intero liraglutide in diversi segmenti, che può generalmente essere diviso in cinque segmenti: da 1 ° al 4 ° aminoacidi, dal 5 ° al 10 ° aminoacidi, dall'11 al 16 ° aminoacidi, dai 17 ° a 24 ° aminoacidi e dal 25 ° al 31 ° aminoacido. Ogni frammento viene sintetizzato separatamente, il che può ridurre la difficoltà e il costo della sintesi dei peptidi e migliorare l'efficienza della sintesi.

Per la sintesi di ciascun frammento, vengono generalmente utilizzati la sintesi in fase solida o i metodi di sintesi in fase liquida. Il metodo di sintesi in fase solida prevede il collegamento dei gruppi carbossilici di aminoacidi alla resina, quindi aggiungere sequenzialmente gli aminoacidi alla resina in sequenza e infine il taglio dei peptidi dalla resina. Il metodo di sintesi in fase liquida prevede la dissoluzione di tutti gli aminoacidi in un solvente organico e quindi la condensa in sequenza per formare frammenti di peptidi.

2. Reazione di accoppiamento

Eseguire la reazione di accoppiamento sui frammenti di 5 peptidi sintetizzati nel passaggio 1 per formare un liraglutide completo. La reazione di accoppiamento può essere effettuata utilizzando agenti di accoppiamento chimico o biologico e il metodo specifico può essere selezionato in base alle esigenze effettive.

Nella reazione di accoppiamento, è necessario collegare il gruppo amminico di ciascun frammento con il gruppo carbossilico del frammento successivo. Per raggiungere questo obiettivo, di solito è necessario utilizzare agenti di condensa come DIC o BOP. Questi agenti di condensazione possono promuovere la reazione tra gruppi aminoi e carbossilici, formando legami peptidici. Nella reazione di accoppiamento, si dovrebbe anche prestare attenzione al controllo delle condizioni di reazione, come la temperatura, il valore del pH e il tempo di reazione, per garantire il progresso regolare della reazione.

3. Purificazione e identificazione

Il liraglutide sintetizzato deve essere purificato e identificato per garantire la purezza e la qualità del prodotto. La purificazione viene generalmente effettuata utilizzando metodi come la cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) o l'elettroforesi, seguita da identificazione mediante spettrometria di massa, risonanza magnetica nucleare e altri metodi. Attraverso questi mezzi, si può garantire che il peso molecolare e la sequenza del prodotto sintetizzato siano coerenti con le aspettative e non ci sono impurità o residui di sottoprodotto.

4. Altre modifiche

Oltre ai passaggi di cui sopra, a volte sono necessarie altre modifiche, come l'aggiunta o la rimozione di gruppi protettivi. Questi passaggi sono anche essenziali in quanto possono proteggere i gruppi attivi nei peptidi dall'essere distrutti o si verificano reazioni laterali, migliorando la qualità e la resa dei sintetizzatiPolvere di liraglutide.

Quanto sopra sono i principali metodi chimici per sintetizzare liraglutide, ma ovviamente alcuni dettagli e tecniche devono essere annotati in funzionamento pratico. Ad esempio, selezionare il sistema di solvente appropriato, controllare la temperatura e il pH e l'utilizzo di catalizzatori appropriati può influire sull'efficienza di sintesi e sulla qualità del prodotto. Pertanto, nel funzionamento pratico, le modifiche e le ottimizzazioni devono essere apportate in base a circostanze specifiche.

Il liraglutide (un agonista del recettore GLP-1 a lunga durata d'azione) svolge un ruolo significativo nel trattamento del diabete. Per garantire la sua controllabilità di qualità, è necessario stabilire metodi analitici scientifici e rigorosi e condurre una validazione sistematica per garantire l'affidabilità di questi metodi. La seguente analisi viene eseguita da tre aspetti: elementi di convalida, metodi di convalida e punti di controllo chiave.

Articoli di verifica del core e requisiti tecnici

Specificità

Obiettivo: dimostrare che il metodo può distinguere il liraglutide da impurità, prodotti di degradazione ed eccipienti.

Strategia di implementazione:

Cromatografia: utilizzare HPLC-UV o UPLC-MS. Attraverso test di degradazione forzata (come alta temperatura, esposizione alla luce, idrolisi a base di acido), generano prodotti di degradazione e verificano il grado di separazione del picco principale e il picco di impurità (maggiore o uguale a 1,5). Ad esempio, nello studio del modello di topo ApoE-/-, dopo che il liraglutide è ossidato, i prodotti di degradazione (come gli addotti di acido formico) devono essere confermati mediante analisi cromatografica per garantire l'effetto di separazione dei prodotti di degradazione dal picco principale.

Spettroscopia: utilizzare un rivelatore PDA per confrontare gli spettri UV del picco principale e delle impurità e confermare la purezza dei picchi.

Controllo in bianco: verificare l'assenza di segnali falsi positivi usando campioni senza liraglutide (come soluzioni eccipienti).

 

Precisione

Obiettivo: garantire che i risultati misurati siano vicini al valore reale e che il tasso di recupero sia controllato entro il 98% - 102%.

Strategia di implementazione:

Test di recupero di aggiunta standard: aggiungere una quantità nota di sostanza di riferimento a un campione con contenuto di liraglutide noto e misura il tasso di recupero. Ad esempio, nell'analisi della formulazione, aggiungere 0,5 mg/mL, 1,0 mg/mL e 1,5 mg/mL di liraglutide alla soluzione eccipiente in bianco, ripetere ogni concentrazione 3 volte e calcolare il tasso di recupero medio.

Metodo di confronto: confrontare con metodi classici (come la titolazione) o metodi verificati (come i metodi di farmacopea) e la deviazione del risultato dovrebbe essere inferiore o uguale al 2%.

 

Precisione

Obiettivo: valutare il grado di vicinanza dei risultati di misurazione ripetuta, con RSD inferiore o uguale al 2%.

Strategia di implementazione:

Ripetibilità: condurre 6 misurazioni consecutive dello stesso campione da parte dello stesso analista, lo stesso strumento e lo stesso lotto di campioni e calcolare l'RSD.

Precisione intermedia: calcolare l'RSD determinando lo stesso lotto di campioni da diversi analisti, strumenti diversi e date diverse. Ad esempio, nella determinazione del contenuto di liraglutide, l'RSD di ripetibilità dovrebbe essere inferiore o uguale all'1,5%e l'RSD di precisione intermedia dovrebbe essere inferiore o uguale al 2,0%.

Riproducibilità: verifica collaborativa da parte di più laboratori (come i metodi standard di Farmacopea), RSD dovrebbe rispettare i principi di orientamento.

 

Limite di rilevamento e limite di quantificazione

Obiettivo: determinare la concentrazione minima che il metodo può rilevare e quantificare il liraglutide.

Strategia di implementazione:

Metodo del rapporto segnale-rumore: determinare LOD con un rapporto segnale-rumore 3: 1 e determinare LOQ con un rapporto segnale-rumore 10: 1. Ad esempio, nel metodo HPLC-UV, il LOD di liraglutide può essere basso di 0,01 ug/ml e il LOQ è 0,05 ug/ml.

Metodo della curva standard: calcola LOD e LOQ usando i segnali di risposta delle sostanze standard a bassa concessione (come 0,1 ug/ml - 1 ug/ml).

 

Linearità

Obiettivo: dimostrare che il segnale di risposta è proporzionale alla concentrazione, con R² maggiore o uguale a 0,999.

Strategia di implementazione:

Test di concentrazione del gradiente: preparare gradienti di concentrazione 5-7 (come 0,1 mg/ml - 2.0 mg/ml) di soluzioni standard, misurare l'area di picco o il valore di risposta e disegnare la curva standard.

Analisi residua: verificare se i residui sono distribuiti in modo casuale e non vi è alcuna deviazione sistematica.

 

Allineare

Obiettivo: determinare l'intervallo di concentrazione applicabile del metodo, di solito il 120% del LOQ al limite superiore della linearità.

Strategia di implementazione:

Determinazione del contenuto: l'intervallo è impostato all'80% - 120% dell'importo etichettato. Ad esempio, l'intervallo di determinazione del contenuto della formulazione di liraglutide dovrebbe essere 0,4 mg/ml - 1.2 mg/ml. Controllo dell'impurità: secondo le linee guida ICH Q3D, impostare l'intervallo limite di impurità (ad es. Impurità singola inferiore o uguale allo 0,5%, impurità totale inferiore o uguale al 2,0%).

Documenti di convalida e gestione dei dati

01

Piano di convalida e rapporto

Definire chiaramente gli elementi di convalida, i metodi, gli standard di accettazione e le procedure di gestione anormali. Ad esempio, se l'RSD di precisione supera il limite, è necessario studiare guasti dello strumento o errori operativi.

Registrare i dati originali (come cromatogrammi, curve standard, tabelle di calcolo del tasso di recupero) per garantire la tracciabilità.

02

Sviluppo del metodo di indicazione di stabilità

Per i test obbligatori di degradazione, dovrebbe coprire l'ossidazione, l'esposizione alla luce, l'idrolisi, ecc. Per simulare le condizioni di conservazione effettive. Ad esempio, il liraglutide si è posizionato a 60 gradi per 48 ore, il tasso di degradazione dovrebbe essere maggiore o uguale al 10% per verificare la capacità del metodo di rilevare i prodotti di degradazione.

03

Conformità normativa

Segui Ich Q2 (R2), USP<1225>e linee guida GMP cinesi per garantire che gli elementi di convalida coprano indicatori fondamentali come specificità e accuratezza.

Per l'analisi dell'impurità elementare, dovrebbe essere conforme a ICH Q3D e USP<233>Requisiti, controllo dei limiti di elementi di classe 1 come AS, CD e PB.

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