Aprotinina78R2S7, formula molecolare C284H432N84O, CAS 9087-70-1, è un inibitore della proteasi che può inibire la tripsina e la chimotripsina, prevenire l'attivazione di altri proteasomi attivi nel pancreas e l'autoattivazione del tripsinogeno. Clinicamente utilizzato per la prevenzione e il trattamento della pancreatite acuta, del sanguinamento causato dalla fibrinolisi e della coagulazione intravascolare disseminata. Può essere utilizzato anche per trattamenti anti-shock. Gli inibitori della proteasi sono sostanze che possono legarsi agli enzimi e ridurre la velocità di degradazione del substrato. Gli inibitori della proteasi con proprietà proteiche sono ampiamente presenti e due tipi di inibitori della proteasi con proprietà proteiche sono stati isolati dai semi di soia: l'inibitore della trypsin Kuniz e l'inibitore Baumann Bellck. Il primo ha un peso molecolare di 20-25 ku, mentre il secondo ha un peso molecolare di 8 ku.
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Ricombinanteaprotinina(RTI16) può inibire la chininasi e la tripsina ed è un inibitore naturale non-specifico della serina proteasi. È una proteina basica a catena singola composta da 58 residui di amminoacidi, con 3 legami disolfuro reticolati nella catena. Per molto tempo l'aprotinn è stato utilizzato per il trattamento della pancreatite acuta. Dopo gli anni '90, l'aprotina ricombinante ha iniziato ad essere utilizzata nella chirurgia cardiotoracica per proteggere le piastrine, ridurre il sanguinamento e l'essudazione e per il trattamento clinico di pazienti con disturbi della coagulazione. Pertanto, la dimensione del mercato dell’aprotinn si è rapidamente espansa ed è diventata uno dei farmaci biochimici più importanti.
Sintesi
Attualmente i preparati di aprotina ricombinante disponibili in commercio sono principalmente estratti di organi come i polmoni bovini, che hanno processi complessi e costi elevati. Pertanto, è di grande importanza esplorare la produzione di aprotina ricombinante utilizzando metodi di ingegneria genetica.
Quando si utilizza un sistema di espressione delle secrezioni, la produzione di aprotinn è generalmente bassa e anche l'attività del prodotto risultante è bassa. Attraverso l'espressione della fusione, si prevede un aumento significativo del livello di espressione dell'aprotinn ricombinante.
A questo scopo è stato costruito un plasmide di espressione di aprotinn ricombinante pGrxA BPTI ed è stato progettato un sito di riconoscimento per FXa tra il partner di fusione e l'aprotinn ricombinante. Dopo essere stato espresso sotto forma di corpo incluso, il partner di fusione è stato purificato e ripiegato mediante filtrazione su gel. Il partner di fusione è stato eliminato da FXa per ottenere una proteina con la stessa attività del prodotto naturale. Attraverso l'ottimizzazione delle condizioni di espressione, la resa è stata significativamente migliorata rispetto ai precedenti sistemi di espressione.
Ottimizzazione dell'espressione dei batteri ingegneristici:
Inoculare i batteri della provetta di glicerolo su piastre di agar LB/AMP, coltivare a 37 gradi per 20 ore, raschiare le colonie e inocularle in 5 mL di terreno liquido LB/AMP a 37 gradi, 200 giri/min e coltivare durante la notte. Inoculare il 5% dell'inoculo in 100 mL di terreno di impasto di mais, coltivare a 37 gradi e 220 giri/min su un agitatore, indurre per 7 ore, quindi centrifugare (8000 giri/min, 5 min, 4 gradi) per raccogliere le cellule batteriche. Pesare il peso umido delle cellule batteriche e rilevarne l'espressione mediante SDS-PAGE al 15%.
Coltivazione in vasche di fermentazione
Coltivazione in vasche di fermentazione:
Utilizzando un serbatoio di fermentazione tedesco Biostat da 30 L, a 37 gradi, con ossigeno disciolto controllato al 20%, pH 7,0. Utilizzando un serbatoio di fermentazione per esprimere la proteina di fusione, sono stati ottenuti 260 g di cellule batteriche umide da 16 L di brodo di fermentazione, circa 16 g/L; Il livello di espressione è di circa il 45%,
Rottura della parete e acquisizione di corpi inclusi di cellule batteriche:
Al termine della coltura, raccogliere le cellule batteriche, aggiungere 1 g di cellule batteriche a 10 mL di soluzione A (50 mmol/L Tris HCl, pH 8,0, 1 mmol/L EDTA), sospenderle accuratamente, sonicare le cellule in un bagno di ghiaccio, lavorare per 30 secondi, intervallo per 10 secondi, potenza 400 W, 30 cicli. Trasferire il liquido in una provetta da centrifuga, centrifugare a 4 gradi e 8000 giri/min per 15 minuti e il precipitato costituirà il corpo di inclusione grezzo.
Preparazione della soluzione di dissoluzione del corpo incluso:
Lavare il corpo di inclusione grezzo con la soluzione B (50 mmol/L di Tris HCl, pH 8,0, 1 mmol/L di EDTA, 1% Triton-X100) due volte, ciascuna volta per 0,5 ore, centrifugare per rimuovere il surnatante e ottenere corpi di inclusione relativamente puri. Aggiungere 1 g di corpi inclusi a 5 mL di soluzione C (50 mmol/L Tris HCl, pH 8,0, 8 mol/L urea, 1 mmol/L EDTA, 5 mmol/L DTT), incubare per una notte a 4 gradi, denaturare e sciogliere, centrifugare a 12.000 giri/min per 15 minuti e raccogliere il surnatante per ottenere la soluzione di dissoluzione dei corpi inclusi. Ottenere aprotina ricombinante.
Effetti farmacologici:
Aprotininainibisce la tripsina umana, l'enzima fibrinolitico, l'angiotensina plasmatica e tissutale attraverso complessi inibitori enzimatici reversibili formati in un determinato rapporto chimico. Le proteasi con attività serina svolgono un ruolo importante nel sistema chinina vasopressina chininogeno, nel sistema del complemento e nel sistema di coagulazione, dove la plasmina e la vasopressina plasmatica svolgono un ruolo critico.
L'aprotinn esercita il suo effetto inibitorio formando un complesso proteasi aprotinn attraverso la porzione attiva della serina sull'enzima. Tuttavia, se combinato con diverse proteasi, mostra costanti di dissociazione diverse. Il legame con la tripsina è il più forte (Ki=0.06nmoN), che è una delle costanti più basse riportate nelle interazioni proteina-proteina (Laydunski et al. 1974). Il legame con l'enzima fibrinolitico umano non è molto forte. A causa dell'elevato valore K del complesso enzimatico inibitore (Ki=1 nmoN), esso può essere reversibile (Wimann, 1980) e il complesso che si lega all'angiotensina plasmatica umana è piuttosto debole (Ki=30 nmol/l), ma ancora entro l'intervallo terapeutico dell'aprotinn (Nakahara, 1983).
Aprotinn si lega non solo alle molecole enzimatiche libere, ma anche agli enzimi che si sono già legati a un terzo componente (se il centro attivo dell'enzima ha ancora capacità legante). Pertanto, l'aprotinn inibisce gli enzimi fibrinolitici liberi e può anche inibire il complesso intermedio della catena chinasi della fibrinolisina formato durante la terapia trombolitica con la catena chinasi (Wimann, 1980).
L'effetto antifibrinolitico dell'aprotinn si basa sull'inibizione della plasmina attivata dall'idrolisi delle proteine. A differenza dei solventi antifibrinolitici sintetici, a causa della sua inibizione diretta della plasmina iperattivata, l'aprotinn non solo protegge il substrato diretto (fibrina) dalla degradazione da parte della plasmina, ma protegge anche il fibrinogeno, i fattori V e VIII nel plasma e l'alfa 2-globulina nel siero.
Negli esperimenti di shock indotto da endotossine e shock ipovolemico, Trasylol può inibire significativamente l'attivazione del chininogeno. (Massion et al1．1972).
Trasylol può prevenire o ritardare lo sviluppo dell'edema interstiziale polmonare (shock polmonare). Il suo effetto inibitorio è dose-dipendente e tempo-dipendente (Lorthioir et al., 1973).
Durante lo shock, il pancreas ischemico può produrre una sostanza peptidica altamente tossica, denominata fattore inibitorio del miocardio (MDF). Questo fattore è strettamente correlato alla morte per shock.
L'MDF può essere rilevato nel plasma di topi, cani, scimmie e esseri umani con shock emorragico, settico, cardiogeno e shock da ustione. L'MDF può causare una diminuzione della contrattilità miocardica in tutti i casi di sanguinamento e, allo stesso tempo, provoca la contrazione dei vasi di resistenza viscerale, portando all'ischemia locale e alla produzione di più MDF. Inoltre, a causa del danno tossico causato al sistema reticoloendoteliale, la sua eliminazione nel flusso sanguigno è ritardata. Trasylol può impedire notevolmente la produzione di MDF (Lefer 1984).
Farmacodinamica:
Dopo l'iniezione endovenosa di Trasylol, la forma originale diaprotininasi distribuisce rapidamente in tutta la fase extracellulare, portando a una rapida diminuzione della concentrazione del farmaco nel sangue (emivita di circa 23 minuti).
Una volta che la distribuzione del farmaco raggiunge l'equilibrio, l'emivita-della diminuzione della concentrazione del farmaco nel sangue 1-4 ore dopo l'iniezione è di circa 150 minuti. Il volume di distribuzione principale (camera centrale) corrisponde a circa il 30%-50% dei liquidi corporei.
Dopo 24 ore di infusione alla dose di 250.000 KIU/h, il paziente ha raggiunto una concentrazione plasmatica costante di 40-50 KIU/ml. Questa concentrazione equivale a circa 1 μmol/l ed è uguale alla normale concentrazione di alfa 2-antifibrinolisina nel plasma.
L'aprotina si accumula nei reni e, in misura minore, nel tessuto cartilagineo. L'arricchimento nei reni è dovuto al legame dell'aprotina ai bordi a spazzola delle cellule epiteliali del tubulo prossimale e l'aprotina è arricchita anche nei lisosomi fagocitici. A causa dell'affinità dell'aprotina alcalina per i proteoglicani acidi, si accumula nel tessuto cartilagineo (Kaller, 1968).
L'arricchimento di aprotina nei lisosomi fagocitici dipende dal meccanismo di trasporto attivo delle cellule epiteliali del tubulo renale e quindi anche dalla funzione delle cellule intatte.
Le concentrazioni nei polmoni, nella milza e nel pancreas sono simili a quelle nel siero. La concentrazione è più bassa nel cervello, nei muscoli, nello stomaco e nell'intestino.
Trasylol in realtà non entra nel liquido cerebrospinale (CSF). Trasylol non è stato rilevato nel liquido cerebrospinale di cani, porcellini d'India, volontari sani o pazienti con o senza infezioni neurologiche.
Solo una quantità molto limitata di Trasylol può passare attraverso la barriera placentare. Dopo l'iniezione endovenosa prima del parto, la concentrazione nel sangue dei neonati era 1/10 della concentrazione nel sangue materno e altri ricercatori non hanno trovato aprotinn nel sangue fetale di madri che avevano già ricevuto l'infusione di Trasylol. La placenta potrebbe non essere completamente impermeabile al Trasylol, ma il suo passaggio è chiaramente un processo molto lento.
Studi in vitro lo hanno dimostrato
Aprotinina, in quanto composto di piccole molecole che resiste alla fibrinolisi, presenta proprietà inibitorie enzimatiche significative e specifiche. Non solo inibisce efficacemente l'attività della tripsina, ma agisce anche ampiamente su altri enzimi proteolitici correlati, svolgendo così un ruolo importante negli esperimenti di biologia cellulare. Soprattutto durante la lisi e l'omogeneizzazione di cellule e tessuti, Aprotinn può fungere da efficiente inibitore della proteasi, prevenendo efficacemente la degradazione accidentale delle proteine bersaglio, che è fondamentale per mantenere l'integrità e l'accuratezza del campione.
L'effetto inibitorio di Aprotinn mostra una chiara dipendenza dalla dose, cioè all'aumentare della sua concentrazione aumenta di conseguenza anche l'effetto inibitorio sull'attività fibrinolitica. Questa funzionalità consente ai ricercatori di controllare in modo più accurato le condizioni sperimentali per ottenere risultati sperimentali più affidabili e riproducibili. Nel frattempo, Aprotinn può anche prolungare il tempo di coagulazione del sangue, confermando ulteriormente il suo importante ruolo nel meccanismo della coagulazione. Esperimenti in vitro hanno dimostrato che Aprotinn è un efficace inibitore della via endogena della coagulazione che può interferire e regolare processi chiave nel processo di coagulazione.
Ricerca in vivo
Aprotini ha anche dimostrato i suoi effetti farmacologici unici. Può inibire significativamente il processo di dissoluzione del coagulo di sangue in vitro, prolungare il tempo di sanguinamento del taglio della coda nei ratti e prolungare il tempo di coagulazione nel plasma umano. Questi risultati suggeriscono che Aprotinn può avere potenziali effetti antiemorragici e antitrombotici. Per convalidare ulteriormente il suo effetto in vivo, i ricercatori hanno condotto esperimenti su un modello di cortocircuito artero-venoso di ratto. I risultati hanno mostrato che l’Apronin può ridurre significativamente il peso dei coaguli di sangue, supportando ulteriormente il suo potenziale come farmaco antitrombotico.
In sintesi, l’Apronin, essendo un composto di piccole dimensioni che inibisce la fibrinolisi, ha dimostrato significative proprietà inibitorie enzimatiche ed effetti farmacologici sia in vitro che in vivo. La sua applicazione negli esperimenti di biologia cellulare fornisce ai ricercatori strumenti potenti, mentre i suoi risultati negli studi in vivo forniscono importanti indizi e basi per il suo sviluppo come farmaco antiemorragico e antitrombotico. In futuro, con ulteriori ricerche sul meccanismo d’azione dell’Aprotnin e studi clinici, ci si aspetta di vedere una sua più ampia applicazione in campo medico.
domande frequenti
A cosa serve il farmaco aprotinina?
L'aprotinina è indicata per uso profilattico per ridurre la perdita di sangue e le trasfusioni di sangue in pazienti adulti ad alto rischio di grave perdita di sangue sottoposti a CABG isolato. (vale a dire intervento chirurgico di bypass aortocoronarico non combinato con altri interventi di chirurgia cardiovascolare).
L’aprotinina è ancora sul mercato?
L'agente antifibrinolitico aprotinina, un inibitore naturale della serina proteasi, erarimosso dal mercato mondiale nell'ottobre 2007.
L’aprotinina è ancora utilizzata in cardiochirurgia?
Le nuove raccomandazioni, che sono state declassate a Classe III(A), riconoscono che l'aprotinina riduce il numero di pazienti adulti che necessitano di trasfusioni di sangue e riduce la perdita totale di sangue e la necessità di ri-esplorazione nei pazienti sottoposti a intervento chirurgico al cuore mase ne sconsiglia l'uso per la conservazione di routine ...
Quanto è efficace l'aprotinina?
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