La scienza dietro i recettori del Fluralaner e del GABA

Fluralanerè diventato uno dei composti isossazolinici più studiati nella moderna parassitologia e farmacologia veterinaria. La sua notevole potenza contro gli ectoparassiti - zecche, pulci e altri artropodi - deriva da un preciso meccanismo molecolare che coinvolge i recettori inibitori dei neurotrasmettitori nel sistema nervoso degli artropodi. Comprendere come il fluralaner interagisce con i recettori GABA apre una finestra sul perché questa molecola funziona in modo così efficace e perché è così promettente per la ricerca continua e lo sviluppo commerciale.

Compressa di fluralaner

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Codice interno:BM-2-079
Fluralaner CAS 864731-61-3
Mercato principale: USA, Australia, Brasile, Giappone, Germania, Indonesia, Regno Unito, Nuova Zelanda, Canada ecc.

Come si lega il Fluralaner ai recettori GABA degli artropodi?

Le basi strutturali del legame selettivo

Il fluralaner è un composto isossazolinico, noto per la sua forte capacità di legarsi ai canali ionici legati al ligando-negli invertebrati. La molecola ha un'impalcatura aromatica che è trifluorometil-sostituita e si adatta molto bene a un punto di legame allosterico nel dominio transmembrana dei canali del cloruro GABA- dei crostacei. Questa tasca è fisicamente separata dal sito di riconoscimento GABA. A volte è chiamato sito di legame TBOB (t-butilbiciclofosforotionato) o sito antagonista non competitivo. Ciò significa che il fluralaner non compete con il GABA per lo stesso posto.

Studi elettrofisiologici sui recettori GABA della Drosophila melanogaster e della Musca domestica hanno confermato che il fluralaner può raggiungere concentrazioni inibitorie nell'intervallo nanomolare- (valori IC₉₀ spesso riportati al di sotto di 10 nM nelle preparazioni di artropodi), che sono molto diverse da quanto poco si lega ai recettori GABA-A nei mammiferi. La molecola è selettiva perché le sequenze delle subunità recettoriali degli artropodi e dei vertebrati sono diverse, soprattutto nelle eliche transmembrana M2 e M3.

Ciò fornisce una spiegazione molecolare del motivo per cui è sicuro per le specie non-bersaglio.

Selettività delle subunità recettoriali negli artropodi

Il fluralaner non funziona allo stesso modo su tutti i sottotipi di recettori GABA. Gli scienziati hanno scoperto che i recettori con la subunità RDL (resistenza al dieldrin) hanno la più forte capacità di legarsi. Questo perché la subunità RDL è la principale subunità inibitoria presente nella maggior parte delle specie di insetti, dalla zecca dalle zampe nere-alla pulce del gatto. La tasca transmembrana idrofobica della subunità RDL si adatta perfettamente alle catene laterali lipofile del fluralaner, mantenendo stabile il complesso farmaco-recettore e bloccando il canale più a lungo.

Fluralaner e l'interfaccia transmembrana dei canali gabati GABA-

Architettura della regione dei pori del canale

I canali del cloro attivati ​​dal GABA fanno parte della superfamiglia dei recettori dell'ansa Cys-. Ciascun recettore attivo è costituito da cinque subunità raggruppate simmetricamente attorno a un poro centrale che conduce gli ioni-. Ciascuna subunità ha quattro eliche nel suo dominio transmembrana (M1–M4). L'elica M2 di ciascuna subunità riveste il poro del canale. Il sito di legame dell'antagonista non competitivo si trova nel punto d'incontro di due eliche M2 e M3 vicine, in profondità all'interno dell'interfaccia transmembrana rivolta ai lipidi. Questo è esattamente dovefluralaneraderisce alla membrana cellulare.

Questa interazione è stata mappata in grande dettaglio utilizzando studi di docking computazionale e analisi di spostamento dei radioligandi.

Con i residui conservati di leucina e treonina nell'elica M2, l'anello isossazolinico del fluralaner forma legami idrofobici cruciali. Allo stesso tempo, il gruppo arilico fluorurato del composto si incunea in uno spazio idrorepellente-formato nel punto in cui M1 e M2 si incontrano. I due punti di contatto formano un complesso stabile e ad alta-affinità che arresta il flusso degli ioni cloruro attraverso il canale.

Conseguenze del blocco transmembrana

La conduttanza del cloruro diminuisce notevolmente quando il poro transmembrana è fisicamente bloccato. Nei neuroni degli artropodi sani, l'afflusso di cloruro controllato dal GABA- è l'elemento principale che impedisce ai neuroni di agire in modo incontrollato.

Lo fa rendendo la membrana più carica e iperpolarizzata. Il contatto transmembrana è dove si deposita il fluralaner, eliminando completamente questo freno. Il risultato è una reazione a catena di depolarizzazione neuronale incontrollata che provoca incapacità motoria, convulsioni e infine paralisi negli artropodi colpiti. Le registrazioni pubblicate di patch-clamp dei neuroni di Rhipicephalus microplus hanno dimostrato che tutti i canali sono bloccati a livelli simili alle esposizioni plasmatiche terapeutiche dopo che il farmaco è stato assunto per via orale o applicato localmente.

Perché l’attivazione del recettore GABA è importante per l’attività del Fluralaner?

Il ruolo dello stato di gate del canale

A prima vista potrebbe non avere senso, ma l'attivazione dei recettori GABA rende più forte l'effetto inibitore del fluralaner. Questo perché il sito di legame dell'antagonista non competitivo nel dominio transmembrana è più facile da raggiungere quando il canale cambia dalla sua forma di riposo (chiusa) alla sua forma aperta (desensibilizzata). Quando la proteina è a riposo, i residui idrofobici bloccano parzialmente la tasca di legame, rendendo più difficile l'ingresso dei farmaci. Il rilascio endogeno di GABA attiva il channel gating, che modifica la forma dell'elica M2. Ciò rende la tasca più ampia e accelera notevolmente la velocità con cui il fluralaner si lega.

Questo effetto di "blocco del canale-aperto" è ben-noto nel campo della farmacologia dei recettori ad anello Cys-. Ciò significa che il fluralaner funziona collegandosi all'attività del GABA nel sistema nervoso degli artropodi. Quindi, le sinapsi attive diventano i posti migliori in cui i farmaci possono accumularsi.

Inibizione del recettore GABA-dipendente dallo stato da parte del fluralaner

Profilazione cinetica dell'interazione farmaco-recettore

L'inibizione dipendente dallo stato- avviene quando una molecola si lega a una proteina bersaglio in modo più forte quando si trova in determinati stati conformazionali. Per il fluralaner, studi che utilizzano uova di Xenopus laevis che producono subunità RDL di artropodi ricombinanti hanno dimostrato che gli stati del recettore aperto e desensibilizzato hanno costanti di associazione molto più elevate rispetto allo stato di riposo. Al contrario, la velocità di separazione rimane lenta indipendentemente dalla forma del canale. Ciò significa che le molecole rimangono nella tasca transmembrana in media per un lungo periodo.

Questo tratto dinamico è utile nella vita reale. Perchéfluralanersostanzialmente rimane bloccato nel canale aperto o rilassato,

Il rilascio ripetuto di GABA a livello delle giunzioni neuromuscolari degli artropodi accumula più farmaco sul recettore, rendendo il blocco più forte nel tempo. Questo processo può aiutare a spiegare perché gli effetti del farmaco durano così a lungo in laboratorio-da settimane a mesi di controllo degli ectoparassiti dopo una sola dose.

Implicazioni per i meccanismi di resistenza

Comprendere la resistenza è utile anche sapere come funziona il legame dipendente dallo stato. Mutazioni puntiformi nella subunità RDL, in particolare la sostituzione A301S/G nell'elica M2, sono state riscontrate in molte popolazioni di Drosophila, zanzare e acari. Queste mutazioni rendono più difficile il legame del fluralaner, compromettendo la complementarità geometrica della tasca transmembrana.

Gli artropodi che presentano questi cambiamenti e sono resistenti ai farmaci hanno valori di IC₉₀ molto più alti. Questo perché i complessi farmaco-recettore sono meno stabili. Per la gestione a lungo termine dei farmaci della classe delle isossazoline, è comunque importante tenere d'occhio i geni RDL nelle popolazioni di parassiti bersaglio.

Dal legame del recettore GABA alla disfunzione del canale del cloro

Interruzione della neurotrasmissione inibitoria

Il fallimento del canale del cloro è l’evento fisiologico più vicino che collega il legame molecolare agli effetti dannosi sugli esseri viventi. In situazioni sane, il cloruro che entra attraverso i canali controllati dal GABA-mantiene il potenziale di membrana negativo nei neuroni dei crostacei e nelle terminazioni nervose motorie. L'equilibrio ionico viene spostato verso una depolarizzazione prolungata della membrana quando il blocco indotto dal fluralaner-blocca questo afflusso. Quando i neuroni sono danneggiati, entrano in uno stato chiamato attivazione tonica, ovvero quando inviano continuamente potenziali d’azione senza essere controllati. Ciò consuma tutte le risorse sinaptiche e rende instabile l'output motorio.

Le registrazioni elettromiografiche dei muscoli delle zampe delle zecche esposti a quantità di isossazolina simili a quelle presenti nel corpo hanno rilevato questo cambiamento in tempo reale, dimostrando che i muscoli sono passati da esplosioni motorie ritmiche a contrazioni tetaniche sostenute entro pochi minuti dall’esposizione al farmaco.

Conduttanza del cloruro e letalità degli artropodi

Esiste un chiaro legame tra la perdita di conduttanza del cloruro e la morte degli artropodi. I ricercatori che hanno misurato il flusso di cloruro attraverso i nervi e i muscoli degli artropodi hanno scoperto che il taglio della conduttanza del cloruro regolato dal GABA-di oltre il 70% provoca costantemente problemi di movimento che non possono essere risolti.

Il dosaggio standard di fluralaner determina concentrazioni che bloccano la conduttanza del cloruro ben al di sopra di questo livello nelle specie di artropodi sensibili. Ciò è particolarmente importante per lo sviluppo di intermedi medicinali perché questo processo funziona allo stesso modo in diversi tipi di artropodi, come zecche dure, zecche molli, pulci e pidocchi, anche se questi gruppi hanno genomi molto diversi. Poiché la regione transmembrana della subunità RDL rimane la stessa, il fluralaner può essere utilizzato come impalcatura per molti tipi diversi di studio e crescita dei parassiti.

Conclusione

Inoltre,Fluralanerha forti effetti antiparassitari che derivano dal blocco dei canali del cloruro regolati dal GABA-dei crostacei su più livelli molecolari. Provoca una reazione a catena di ipereccitazione neuronale che uccide gli artropodi vulnerabili a concentrazioni nanomolari legandosi all'interfaccia transmembrana dei recettori contenenti RDL-, sfruttando l'accessibilità dipendente dallo stato- e bloccando persistentemente la conduttanza del cloruro. È sicuro perché si lega solo a determinati tipi di recettori degli artropodi e non ai recettori dei mammiferi. Con l’avanzamento della ricerca sulla chimica dell’isossazolina, il fluralaner continuerà a essere utilizzato nel mondo degli affari e come modello per la progettazione di nuove molecole antiparassitarie.

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