BPL-1(collegamento:https://www.bloomtechz.com/synthetic-chemical/peptide/GLP-1-peptide-CAS-87805-34-3.html) è un ormone polipeptidico costituito da 30 amminoacidi. Con la ricerca approfondita sulla BPL-1, sono stati sviluppati sempre più metodi sintetici. Questo articolo introdurrà sistematicamente i metodi di sintesi attualmente conosciuti di GLP-1.
Metodo 1, sintesi in fase solida:
La sintesi in fase solida è un metodo ampiamente utilizzato per la sintesi di peptidi e proteine, ed è anche comunemente usata per la sintesi di GLP-1. Nella sintesi in fase solida, la struttura del nucleo si forma collegando il primo amminoacido alla resina. Successivamente, l'amminoacido successivo viene aggiunto in sequenza e fatto reagire chimicamente con un agente di condensazione appropriato. Infine, il prodotto target può essere ottenuto scindendo il polipeptide dalla resina.
L'importanza della sintesi in fase solida è che consente l'automazione e la produzione su larga scala della sintesi di peptidi. Gli attuali metodi di sintesi in fase solida tradizionali includono Fmoc e Boc. Tra questi, il metodo Fmoc utilizza il gruppo protettivo N-Fmoc per proteggere il peptide, mentre il metodo Boc utilizza tert-butilossicarbonile per proteggere il gruppo carbossilico.
Metodo due, sintesi in fase liquida:
La sintesi in fase liquida è un metodo tradizionale di sintesi peptidica in cui i reagenti vengono posti nella fase liquida per la reazione. Il vantaggio della sintesi in fase liquida è che le condizioni di reazione sono blande e adatte alla modifica di strutture chimiche sensibili. Tuttavia, a causa dei troppi reagenti, il processo di purificazione è relativamente macchinoso. Le reazioni chimiche nella sintesi in fase liquida includono:
1. Reazione di condensazione:
La reazione di condensazione è una delle reazioni più basilari nella sintesi dei peptidi, ovvero il gruppo carbossilico avviato da agenti di condensazione come DCC e HOBt è collegato al gruppo amminico dell'amminoacido attraverso la reazione di acilazione. Le condizioni di reazione sono blande e la resa è elevata.
2. Reazioni di eliminazione:
La reazione di eliminazione consiste nel ridurre la metionina a ditiolo mediante NaBH4 e altri agenti riducenti, rendendola inattiva. La reazione deve essere condotta in condizioni basiche.
3. Rimozione dei gruppi protettivi:
A causa delle diverse funzioni degli amminoacidi nella catena peptidica, verranno utilizzati diversi gruppi protettivi per la protezione. Dopo che la sintesi è completa, il gruppo protettore deve essere rimosso. Per il metodo Fmoc, la piperidina viene solitamente utilizzata per rimuovere Fmoc; mentre per il metodo Boc, TFA viene utilizzato per rimuovere Boc.
Metodo tre, sintesi chimica:
Il GLP-1 è un ormone polipeptidico con importanti attività biologiche. La sua sintesi può essere realizzata con vari metodi, tra i quali la sintesi chimica è uno dei metodi più comunemente usati. Il vantaggio della sintesi chimica è che può produrre prodotti target altamente puri, adatti per la produzione su larga scala. Il metodo di sintesi chimica e le fasi dettagliate del GLP-1 verranno presentati di seguito.
1. Percorso sintetico e selezione del gruppo di protezione:
La molecola del GLP-1 è composta da 36 amminoacidi, inclusi 21 amminoacidi di tipo L e 15 di tipo D. Prima di eseguire la sintesi, è necessario selezionare una via sintetica adatta e selezionare il gruppo protettivo corrispondente in base alle condizioni di sintesi. La sintesi in fase solida Fmoc viene solitamente utilizzata per la sintesi automatizzata su larga scala. Questo metodo utilizza la protezione N-9-fluoroimido carbossilica (N-Fmoc) come gruppo protettivo e deve anche selezionare un gruppo protettivo secondario appropriato (come terz-butile o metile) per garantire la protezione di siti specifici. Ogni volta che viene aggiunto un nuovo amminoacido, il gruppo protettivo Fmoc deve essere prima rimosso, quindi viene aggiunta la sostanza di accoppiamento protetta dell'amminoacido successivo.
2. Sintesi della sequenza amminoacidica principale:
La sequenza centrale di GLP-1 è costituita da 21 aminoacidi, tra cui una serina chiave e quattro sequenze dipeptidiche dell'acido prolil-glutammico. Nella sintesi in fase solida, la sintesi della sequenza centrale può essere suddivisa nelle seguenti fasi:
2.1. Aggiungere il carbammato di acido acetico (Fmoc-NH-CH2CO2Et) e 2-Cl-Trt-Cl alla resina sintetica in fase solida ed eseguire la reazione di condensazione con l'agente di accoppiamento DIC/NMM.
2.2. Rimuovi il gruppo di protezione Fmoc deproteggendo la reazione di gruppo.
2.3. Aggiungere l'amminoacido successivo, ripetere il passaggio 1 e il passaggio 2 in sequenza fino a quando la sequenza principale non viene sintetizzata.
2.4. Formazione di strutture pentapeptidiche su resina in fase solida. Aggiungere il reagente di acetalizzazione alla resina in fase solida, reagire con l'agente di riconoscimento N-terminale (come HBTU), aggiungere il gruppo di protezione della catena laterale di serina come agente riducente ausiliario e quindi rimuovere il gruppo di protezione Fmoc.
2.5. Sotto la catalisi del Bacillus subtilis transferasi (ProTide), la struttura pentapeptidica subisce una reazione di scambio con il precursore della serina iodoacetato.
3. Sintesi della restante sequenza amminoacidica:
Dopo aver completato la sintesi della sequenza centrale, è necessario continuare ad aggiungere gli amminoacidi rimanenti, compresi gli amminoacidi di tipo L e D. L'aggiunta di questi amminoacidi deve iniziare dalla sequenza centrale, aggiungere l'amminoacido successivo in sequenza e utilizzare l'agente di condensazione corrispondente per eseguire reazioni chimiche fino a quando non viene sintetizzata una molecola polipeptidica GLP-1 completa. Durante questo processo, è anche necessario selezionare un gruppo protettivo appropriato come richiesto, ed eseguire le fasi di reazione, rimozione del gruppo protettivo e aggiunta di amminoacido in sequenza.
4. Trattamento con idrossido di sodio:
Dopo che tutti gli amminoacidi sono stati aggiunti, sulla resina in fase solida si forma una catena peptidica sintetizzata in modo incompleto e deve essere elaborata per formare una molecola peptidica completamente formata. In primo luogo, il peptide non formato dovrebbe essere idrolizzato dall'idrossido di sodio, in modo che il gruppo carbossilico C-terminale originariamente attaccato alla resina sia staccato dalla resina e il gruppo protettivo sia staccato in acqua. Dopo la reazione di idrolisi, si ottiene il prodotto target.
5. Precipitazioni e lavaggi:
Dopo il trattamento, la soluzione idrolizzata viene trattata con acido per far precipitare il prodotto desiderato. Successivamente, il pellet è stato risospeso in acqua, seguito da un lavaggio intensivo per rimuovere le impurità.
6. Purificazione:
Il passaggio finale è la purificazione del prodotto desiderato, solitamente mediante cromatografia liquida ad alta prestazione. Durante questo processo, la purezza del prodotto può essere determinata rilevando il picco della soluzione nello spettro di massa. In breve, la sintesi chimica del GLP-1 richiede cicli multipli di reazioni complesse e rigorosi processi di purificazione per ottenere infine il prodotto target attivo.
Metodo quattro, biosintesi:
Il GLP-1 è un importante ormone polipeptidico con vari effetti fisiologici, tra cui la promozione della secrezione di insulina, la soppressione dell'appetito, la riduzione del peso corporeo e il mantenimento della sensibilità all'insulina, ecc. Il metodo di biosintesi del GLP-1 viene sintetizzato principalmente dalle cellule L nella ghiandola pancreatica e la sua velocità di sintesi è regolata con l'assunzione dietetica. I passaggi dettagliati sono introdotti come segue:
1. Lavoro preparatorio prima della sintesi:
Prima della biosintesi del GLP-1, è necessario svolgere alcuni lavori preparatori, inclusa la determinazione del tipo cellulare utilizzato, l'impostazione delle condizioni di coltura e la selezione dell'enzima catalitico appropriato. Le cellule L sono la principale fonte di sintesi di GLP-1 perché contengono i precursori di due ormoni, GIP (glucagon-like peptide 1) e GLP-1. Le cellule L possono essere isolate dall'epitelio intestinale di conigli o topi. Prima della biosintesi, le cellule devono essere coltivate in numero sufficiente e devono essere fornite sostanze nutritive sufficienti e condizioni di coltura adeguate. Inoltre, è necessario selezionare l'enzima catalitico appropriato per promuovere la reazione.
2. Sintesi ed elaborazione dei precursori:
La biosintesi del GLP-1 si verifica principalmente nelle cellule L e il suo precursore è composto da due ormoni, GIP e GLP-1. Dopo essere entrati nelle cellule endocrine, GIP e GLP-1 vengono processati da enzimi proteolitici e scissi in singoli peptidi. Una serie di enzimi e cofattori sono coinvolti in questo processo, tra cui la polipeptide acidosi precursore (PC2), l'isomerasi e i fattori di adesione tardiva.
3. Conversione reciproca tra segmenti polipeptidici:
Dopo l'elaborazione, i peptidi GIP e GLP-1 vengono ricombinati per formare il polipeptide GLP-1. Questo processo richiede l'uso del peptide 1 simile al glucagone (GLP-1) come modello a cui vengono combinati altri singoli peptidi per formare nuovi polipeptidi compositi. Questo processo richiede anche alcuni enzimi e fattori specifici, tra cui la proormone convertasi 1/3 (PC1/3) e la carbossipeptidasi E (CPE).
4. Secrezione di GLP-1:
Dopo che il GLP-1 è stato sintetizzato ed elaborato, viene immagazzinato nel citoplasma e nelle vescicole interne delle cellule endocrine. Quando stimolate dalla dieta, le cellule endocrine rilasciano GLP-1 ed entrano nella circolazione sanguigna attraverso i microvasi. Questo processo è regolato e controllato attraverso una serie di percorsi di trasduzione del segnale, tra cui cAMP-Ca2 piùe così via.
In breve, la biosintesi del GLP-1 comporta l'azione congiunta di più collegamenti e fattori. La combinazione di biosintesi e sintesi chimica può fornire una base e un supporto migliori per la ricerca e la produzione di GLP-1.
Metodo cinque, sintesi enzimatica:
La sintesi enzimatica è la sintesi di catene peptidiche attraverso la catalisi di enzimi biologici. Rispetto ai tradizionali metodi di sintesi in fase liquida, la sintesi enzimatica può essere effettuata a temperatura ambiente ed è possibile selezionare un'ampia gamma di materie prime. Enzimi come theta-liquid sintasi, AEP, ACE, ecc. Sono solitamente usati per catalizzare la sintesi.
In conclusione, i metodi sopra menzionati sono metodi fattibili per la sintesi di GLP-1. Diversi metodi sono adatti a diverse condizioni sperimentali e ambienti di produzione farmaceutica.